Afritunar-umritunarkomplex af kórónuveirunni: mikilvæg og sértæk NMPýlering NiRAN-RdRp undireininga á varðveitta staði í nsp9

Ritstýrt af Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Kaliforníu, samþykkt 25. desember 2020 (endurskoðað 25. október 2020)

Við greinum frá samspili milli undireininga við afritun kórónavírus-umritunarfléttna, sem eru nauðsynleg fyrir afritun og þróunarvernd.Við lögðum fram vísbendingar um að NiRAN lénið sem tengist nsp12 hafi núkleósíð mónófosfat (NMP) transferasavirkni í trans, og auðkennt nsp9 (RNA bindandi prótein) sem markmið þess.NiRAN hvatar samgilda tengingu NMP hlutans við varðveitta nsp9 amínóendainn í hvarfi sem byggir á Mn2+ jónum og aðliggjandi varðveittum Asn leifum.Það kom í ljós að NiRAN virkni og nsp9 NMPýlering eru nauðsynleg fyrir afritun kransæðaveiru.Gögnin gera okkur kleift að tengja þessa virkni hreiðursímmerkis veirunnar við fyrri athuganir í þeirri tilgátu að upphaf RNA nýmyndunar í flokki RNA veira sé í samræmi við virkni og þróun.

RNA-háði RNA-pólýmerasi (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae og 12 aðrar fjölskyldur) er tengdur amínó-enda (N-enda) léninu í próteininu sem ekki er byggt (nsp) sem losað er úr fjölpróteininu, sem kallast NiRAN 1ab er samsett úr veiru aðalpróteasa (Mpro).Áður var greint frá eigin GMPýlerunar/UMPýleringarvirkni slagæðaveiru NiRAN-RdRp nsp og það var lagt til að myndaði tímabundið fyrir flutning á núkleósíð mónófosfati (NMP) til (nú óþekkt) veirunnar og/eða frumulíffjölliðunarhlutir.Hér sýnum við að kransæðavírusinn (Human Coronavirus [HCoV]-229E og Alvarlegt bráða öndunarfæraheilkenni Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) hefur Mn2+ háða NMPýlerunarvirkni, sem er unnin úr nsp9 með myndun Mpro-miðlaðs nsp9 eftir N-enda flanking nsps losnar með próteingreiningu, fosfóramídatet er tengt við aðal amínið (N3825) við N-enda nsp9.Uridín þrífosfat er ákjósanlegur núkleótíð í þessu hvarfi, en adenósín þrífosfat, gúanósín þrífosfat og cýtidín þrífosfat eru einnig hentug samhvarfefni.Stökkbreytingarannsóknir með því að nota raðbrigða kransæðaveiru nsp9 og nsp12 prótein og erfðabreytt HCoV-229E stökkbrigði ákváðu leifarnar sem nauðsynlegar eru fyrir NiRAN-miðlaða nsp9 NMPýleringu og vírusafritun í frumurækt.Gögnin staðfestu spá um NiRAN virka stað leifa og ákváðu mikilvægu hlutverki nsp9 N3826 leifa í nsp9 NMPýleringu og vírusafritunar in vitro.Þessi leifar er hluti af varðveittu N-enda NNE þrípeptíðröðinni og reyndist vera eina óbreytilega leifin af nsp9 og homologum þess í kransæðaveirufjölskyldunni.Þessi rannsókn gefur traustan grunn fyrir starfræna rannsókn á NMPýleringarvirkni annarra hreiðra veira og leggur til möguleg markmið fyrir þróun veirueyðandi lyfja.

Nidovirales jákvætt-strengja RNA veira sýkir ýmis hryggdýr og hryggleysingja (1, 2).Pöntunin inniheldur nú 14 fjölskyldur (3), þar af hefur Coronavirus fjölskyldan verið rannsökuð mikið á undanförnum 20 árum.Á þeim tíma komu þrjár kórónuveirur með dýrasjúkdómum upp úr dýrahýslum og ollu stórfelldum uppkomu alvarlegra öndunarfærasýkinga í mönnum.Þar með talið viðvarandi heimsfaraldur af völdum alvarlegra bráða smitsjúkdóma.Öndunarfæraheilkenni Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nídóvírusar deila sameiginlegu erfðamengiskipulagi og undireining himnubundinna afritunar-umritunarfléttunnar (RTC) er kóðuð í 5-?²-enda tveimur þriðju hlutum og aðalbyggingarundireiningu veiruögnarinnar, auk nokkurra fylgihluta. .Prótein, kóðað í 3??² endaþriðjungi erfðamengisins (1).Fyrir utan eina fjölskyldu planarian veira (Monoviridae) (8), kóða allar hreiður veirur RTC undireiningar í tveimur stórum opnum lesrömmum (ORF) ORF1a og ORF1b, sem eru þýddar úr erfðafræðilegu RNA af.ORF1a kóðar fjölprótein (pp) 1a og ORF1a og ORF1b kóða sameiginlega fyrir pp1ab.Með almennri þátttöku aðalpróteasans (Mpro) sem er kóðaður af ORF1a, eru bæði pp1a og pp1ab unnin á próteingreiningu í margs konar prótein sem ekki eru uppbyggjandi (nsps), einnig þekkt sem 3CLpro, vegna þess að það hefur samsvörun við 3Cpro picornaveirunnar ( 9).Talið er að þessar nsps séu settar saman í stóra kraftmikla RTC, hvata myndun erfðafræðilegs RNA (afritunar) og sett af undirerfðafræðilegu RNA (umritun), og eru notuð til að samræma tjáningu ORF sem staðsett er aftan við ORF1b (10? ? ?12).

Kjarna RTC inniheldur RNA-háðan RNA pólýmerasa (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) og nokkur RNA vinnsluensím, sem eru aðallega kóðuð í ORF1b og í kransæðafjölskyldunni. Það inniheldur nsp12-nsp16 og nsp9-nsp12 í Arterioviridae fjölskyldunni (sjá tilvísun 10ââ 12).RdRp og HEL1 tákna tvö (fimmtungur) varðveitt lén af fuglahreiðurveiru og hafa samsvörun meðal annarra RNA veira.Talið er að kjarnaafrit sé aðstoðað af öðrum undireiningum, þar á meðal nokkrum litlum nsps sem losnar frá karboxýenda (C-enda) svæðinu á pp1a, neðan við Mpro (kórónaveiru nsp5 og slagæðaveiru nsp4, í sömu röð).Þeir hafa takmarkaða fjölskylduvernd og fjölbreytta starfsemi (farið yfir í tilvísun 10ââ12).

Tiltölulega nýlega fannst lén með einstökum raðmyndareiginleikum á amínóendanum (N-endanum) við hlið RdRp í öllum hreiðrum vírusum, en engum öðrum RNA veirum (16).Byggt á staðsetningu þess og núkleótíðtransferasa (núkleósíð mónófosfat [NMP] transferasa) virkni, er þetta lén nefnt NiRAN (Nestvirus RdRp-tengdur núkleótíðtransferasi).Tveggja léna samsetning NiRAN-RdRp myndar nsp12 í Coronaviridae fjölskyldunni og nsp9 í Arterioviridae fjölskyldunni, og í öðrum nestoviridae er búist við að NiRAN-RdRp losni sem óháð nsp frá veirufjölpróteininu.Í kransæðaveirunni inniheldur NiRAN lénið ??1/450 leifar og er tengt C-enda RdRp léninu í gegnum tengisvæðið (16?19).Í hestaslagæðaveiru (EAV) (Arteriviridae) sýnir raðbrigða nsp9 Mn2+ jónaháða (sjálf) UMPýlerunar- og GMPýleringarvirkni, sem er háð þremur varðveittum raðarbösum í nestoveiru, AN, BN og CN Leifarnar í röðinni.Þar sem N stendur fyrir NiRAN) (16).N-enda hlið þessara mótífa er minna íhaldssamt mótíf preAN.Sumar þessara leifa eru einnig varðveittar í fjarskyldum próteinkínasum, þar sem sýnt hefur verið fram á að þær taka þátt í bindingu núkleósíðþrífosfats (NTP) og hvatavirkni (20, 21).Í samræmi við þessa athugun er hægt að setja saman nokkrar lykilleifar af virkum stöðum í gerviefninu SelO frá Pseudomonas syringae með nýútgefnu SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ofursamstæðunni.Varðveitt kórónavírus NiRAN leifar ofan í rafeinda örbyggingu.Raðbrigðaprótein (17).Það er getgátur um að skjalfest (sjálf) U/GMPýlering muni framleiða tímabundið ástand til að flytja NMP til (nú óþekkt) hvarfefni (16), og byggingarlíkindi milli NiRAN og próteinkínasa (17, 19) ) Er tilgátan að NiRAN breytir öðrum próteinum.

Margir eiginleikar, þar á meðal einstök og einstök kerfisbundin tengsl við hreiðraða vírusa og erfðafræðilegan aðskilnað frá RdRp, gera NiRAN að hæfilegu lykilstjórnunarensími fyrir hreiðraða vírusa, sem er mikilvægt fyrir tilkomu þeirra og auðkenni.Áður voru þrjár mögulegar aðgerðir sem fela í sér NiRAN til að stjórna erfðamengi / undirerfðafræðilegri þýðingu eða afritun / umritun kallaðar.Þegar litið er til þeirra af skornum skammti og ófullnægjandi gagna sem til eru á þeim tíma hefur hver aðgerð sína kosti og galla (16).Í þessari rannsókn stefnum við að því að sameina lífefnafræðilegar og öfugar erfðafræðilegar rannsóknir á kransæðaveirunum sem tákna ættkvíslirnar tvær og setja niðurstöður okkar í þróunarbakgrunn náttúrulegrar stökkbreytingar kórónaveirunnar fjölskyldunnar, til að öðlast innsýn í þetta dularfulla ríki.Við greinum frá miklum framförum í skilningi á NiRAN með því að bera kennsl á náttúruleg skotmörk í RTC, sem (meðal þriggja tiltækra tilgáta) stuðlar að hlutverki þessa sviðs við að koma af stað myndun hreiðurs vírus RNA.Þessi rannsókn opnar einnig möguleika fyrir önnur hlutverk NiRAN á viðmóti vírushýsilsins.

Til þess að einkenna ensímeiginleika kórónuveiru nsp12 tengda NiRAN lénsins, framleiddum við raðbrigða kórónavírus 229E (HCoV-229E) nsp12 í E. coli, með His6 merki við C-enda, og sameinuðum prótein með [α32-P ] Ræktið saman með NTP í viðurvist MnCl2 eins og lýst er í Efni og aðferðum.Greining á hvarfefninu gaf til kynna tilvist geislamerkts próteins sem flytur samhliða nsp12 (106 kDa), sem gefur til kynna að kórónavírus nsp12 hvati myndun samgildra próteina-NMP adducts, helst myndað með uridine monophosphate (UMP) (Mynd 1A) Og B).Megindleg greining sýndi að samanborið við önnur kirni jókst merkisstyrkur UMP innlimunar um 2 til 3 sinnum (Mynd 1C).Þessi gögn eru í samræmi við spáð NMP flutningasavirkni NiRAN léns kransæðaveirunnar (16), en benda til þess að núkleótíðval NiRAN léns kransæðaveirunnar og slagæðaveiru séu mismunandi.

Sjálf-NMPýleringarvirkni HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) var ræktað með tilnefndu [α-32P] NTP í viðurvist 6 mM MnCl2 í 30 mínútur (sjá Efni og aðferðir fyrir nánari upplýsingar).Hvarfafurðirnar voru aðskildar með SDS-PAGE og litaðar með Coomassie brilliant blue.(B) Geislamerkta próteinið er sýnt með fosfórmyndatöku.Staðsetningar nsp12-His6 og próteinsameindamassamerkja (í kílódaltonum) eru sýndar í A og B. (C) Styrkur geislavirka merkjanna (meðaltal ± SEM) var ákvarðaður út frá þremur sjálfstæðum tilraunum.*P≤0,05.Merkisstyrkur (prósenta) tengist UTP.

Þrátt fyrir að sýnt hafi verið fram á að NiRAN-tengd ensímvirkni sé nauðsynleg fyrir afritun EAV og SARS-CoV í frumurækt (16), hefur sértæk NiRAN virkni og hugsanleg markmið ekki enn verið ákvörðuð.Nýlega greint frá uppbyggingu líkt milli NiRAN og fjölskyldu próteina með prótein kínasa-líkar fellingar (17, 22) varð til þess að við prófuðum þá tilgátu að NiRAN hvati NMPýleringu annarra próteina.Við bjuggum til mengi hugsanlegra einsleitra marka, þar á meðal prótein sem ekki eru uppbyggjandi kóðuð af HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), sem hvert innihélt C-enda His6 merki (SI viðauki, Tafla S1), Og ræktaðu þessi prótein með [α32-P] uridín þrífosfati ([α32-P]UTP) í nærveru eða fjarveru nsp12.Nautasermi albúmín og MBP-LacZα samrunaprótein framleitt í E. coli þjónuðu sem viðmið (Mynd 2A, brautir 1 til 7).Geislamerkta próteinið var greint með natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (SDS-PAGE) og sjálfsgeislun og kom í ljós að sterkt geislavirkt merki var í hvarfinu sem innihélt nsp12 og nsp9.Staða merkisins samsvarar sameindamassa nsp9, sem gefur til kynna nsp12-miðlaða UMPýleringu á nsp9 (Mynd 2B, lag 7).Engin önnur prófprótein reyndust vera UMPýleruð, sem leiddi til þess að við komum að þeirri niðurstöðu að nsp9 sé sérstakt hvarfefni nsp12.Í samræmi við sjálf-NMPýleringargögnin sem sýnd eru á mynd 1, er nsp12 fær um að flytja öll fjögur NMP til nsp9, þó skilvirknin sé önnur, UMP> adenósín mónófosfat (AMP)> gúanósín mónófosfat (GMP)> cýtidín mónófosfat (CMP) ) ( mynd).3 A og B).Við þær aðstæður sem notaðar eru í þessari greiningu (styttu hvarf og útsetningartíma, minnkaðu styrk nsp12; efni og aðferðir), var ekki hægt að greina sjálfs-NMPýleringu nsp12 (samanber mynd 2B, braut 7 og mynd 1B), sem reyndist árangursrík (Og margar umferðir) UMP færðist úr nsp12 í nsp9.UMP transferasavirkni krefst þess að Mn2+ jónir séu til staðar, eins og sýnt er á mynd 3C, á meðan aðeins lágmarksvirkni UMP transferasa sást í nærveru Mg2+ og engin virkni í viðurvist hinna tveggja tvígildu katjónanna sem prófaðar voru.Svipuð gögn voru fengin í NMPýleringarprófum sem innihéldu cýtidín þrífosfat (CTP), gúanósín þrífosfat (GTP) og adenósín þrífosfat (ATP) (SI viðauki, mynd S1).

HCoV-229E nsp12-miðluð UMPýlering á nsp9.Röð próteinhvarfefna (þar á meðal sermi albúmíns úr nautgripum, MBP-lacZα og röð af HCoV-229E nsps merktum C-enda His6 sem kóðað er af ORF1a) voru notuð til að meta UMPýleringarvirkni HCoV-229E nsp12-His6⁺ miðlaðs prótein.Ræktaðu próteinið með [α-32P] UTP í 10 mínútur í fjarveru (A) eða nærveru (B) nsp12 eins og lýst er í efni og aðferðum.Efst á A og B er sýnt SDS-pólýakrýlamíð hlaup litað með Coomassie Brilliant Blue og neðst á A og B eru samsvarandi sjálfgeislamyndir sýndar.Staða próteinsameindamassamerkisins (í kílódaltonum) er gefin upp til vinstri.Staða nsp12-His6 (B, efst) og geislavirka merkið sem sést við ræktun nsp12-His6 með nsp9-His6 (B, braut 7) eru einnig sýnd, sem gefur til kynna að [α-32P]UMP til nsp9-His6 (12,9 kDa), sem ekki sást fyrir önnur prótein sem prófuð voru.

HCoV-229E NiRAN-miðluð lífefnafræðileg og veirufræðileg einkenni nsp9 NMPýleringar.(A og B) Hlutverk núkleótíðsamhvarfefnisins sem notað er í hvarfinu.Nsp12-His6 og nsp9-His6 er blandað saman og ræktað í nærveru mismunandi [α-32P] NTPs í stöðluðu NMPýlerunarprófinu.(A, efst) Coomassie-litað nsp9-His6 aðskilið með SDS-PAGE.(A, neðst) Sjálfsröntgenmynd af sama svæði hlaupsins.(B) Hlutfallsleg virkni (meðaltal ± SEM) í viðurvist tilnefnds núkleótíðaþátta er ákvörðuð út frá þremur sjálfstæðum tilraunum.*P≤0,05.(C) Hlutverk málmjóna.Sýnt er staðlað NMPýlerunarpróf í viðurvist [α-32P] UTP og mismunandi málmjóna, hver með styrkleika 1 mM.Í C, efst, Coomassie litað nsp9-His6 er sýnt, og í C, neðst, er samsvarandi sjálfsmyndataka sýnd.Stærð merkta próteinsins (í kílódaltonum) er sýnd vinstra megin við A og C. (D) Stökkbreytt form HCoV-229E nsp12-His6 sem ber tilgreinda amínósýruskiptingu er í [α-32P]UTP, eins og lýst er í Efni og aðferðum.Hið geislamerkta nsp9-His6 sem framleitt er í NMPýlerunarhvarfinu er greint með fosfórunarmyndgreiningu (D, efst).Hlutfallsleg virkni miðað við villigerð (wt) prótein er sýnd í D og botninn er tekinn sem meðaltal (±SEM) úr þremur óháðum tilraunum.Stjörnumerki gefa til kynna útskipti á leifum sem ekki eru varðveittar.(E) Veirutíterinn í ræktunarfljótandi vökva p1 frumna sem fékkst 24 klukkustundum eftir sýkingu var ákvarðaður með skellugreiningu.Merkjaskiptin í NiRAN léninu í hönnuðu HCoV-229E stökkbrigði eru sýndar (númer leifa byggist á staðsetningu þeirra í pp1ab).Stökkbreytti nsp12_DD4823/4AA, sem skorti afritun, RdRp virka staði var notaður sem viðmið.

Til að öðlast dýpri skilning á virka stað NiRAN og ákvarða leifarnar sem tengjast virkni nsp9-sértæks NMP transferasa, gerðum við stökkbreytingagreiningu, þar sem við skiptum út íhaldssömu leifunum í NiRAN AN, BN og CN mótífunum ( 16) Það er Ala (SI viðauki, mynd S2).Að auki voru áhrif íhaldssamra Arg-til-Lys eða Lys-til-Arg útskipta metin í tveimur tilvikum.Sem (neikvæð) stjórn er leifum sem eru ekki eða minna varðveitt í NiRAN léni kransæðavírusa og annarra hreiðraðra vírusa skipt út fyrir Ala. Í stað K4116A (í mótíf preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (mótíf) BN) og D4280A (CN) draga verulega úr eða jafnvel útrýma nsp9 NMPýleringu í gegnum nsp12, en prótein með íhaldssamar útskiptingar (R4178K), K4116R) halda 60% og 80% af virkni sinni, sem gefur til kynna að slökun á takmörkunum á sitt hvoru megin. keðjur eru eðlisefnafræðilega viðkvæmar (mynd 3D).Að skipta út nokkrum öðrum varðveittum leifum E4145A, D4273A, F4281A og D4283A er miklu minna skaðlegt og nsp9 UMPýlering minnkar aðeins í meðallagi.Svipaðar niðurstöður fengust í nsp9 NMPýlerunarhvörfum sem taka þátt í öðrum NTPs (Mynd 3D og SI viðauki, mynd S3), sem staðfestir að áhrifin sem sjást á sérstakar amínósýruskipti eru óháð tegund núkleótíðasamhvarfefnis sem notuð er.Næst prófuðum við möguleg áhrif þessara nsp12 útskipta á afritun kransæðaveiru í frumurækt.Í þessu skyni notuðum við viðeigandi erfðabreytt DNA (cDNA) sniðmát sem var klónað í raðbrigða bóluefnisveiru (23, 24) til að umrita 5 -7 frumur.Títrun smitandi veiruafkvæma framleidd í þessum frumum sýndi að flestir HCoV-229E NiRAN stökkbrigði voru ekki framkvæmanlegir (Mynd 3E).Hópur ólífvænlegra veiru stökkbrigða inniheldur val sem hefur verið sýnt fram á að útrýma eða draga verulega úr NMP transferasavirkni in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), en það eru tveir aðrir kostir (K4116R, E4145A) % frátekið?NMPýleringarvirkni þeirra in vitro bendir til þess að viðbótartakmarkanir séu um að ræða.Á sama hátt framleiddu tvær aðrar stökkbreytingar (R4178K, F4281A) sem ollu hóflegri minnkun á NMPýleringarvirkni NiRAN in vitro lifandi vírusa, en þessar vírusar lækkuðu verulega títra með eftirmyndun.Í samræmi við in vitro virknigögnin sem sýnd eru á mynd 3D, koma í stað fjögurra annarra leifa sem ekki eru varðveitt í kransæðavírus og/eða öðrum hreiðruðum vírusum (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) framleiddu lífvænlegar veirur. Afkvæmið, þrátt fyrir að hafa í meðallagi skert títra miðað við villigerð veirunnar (mynd 3E).

Til að kanna hvort NiRAN-miðluð NMP transferasa virkni sé háð virka RdRp léninu, voru tvær varðveittu Asp leifar sem taka þátt í samhæfingu tvígildra málmjóna (11) í RdRp mótíf C skipt út fyrir Ala. Próteinið sem myndast nsp12_DD4823/4AA heldur nsp9 NMPýleringarvirkni þess, sem gefur til kynna að nsp12-miðluð in vitro nsp9 NMPýleringarvirkni krefst ekki pólýmerasavirkni (SI viðauki, mynd S4).

Eftir að hafa staðfest nsp9-sértæka NMP transferasa virkni fyrir nsp12, reyndum við að einkenna NMP-nsp9 adduct með massagreiningu (MS).Heildar próteinmassaróf raðbrigða HCoV-229E nsp9 sýndi hámark við 12.045 Da (Mynd 4A).Viðbót á nsp12 breytti ekki gæðum nsp9, sem gefur til kynna að nsp12 og nsp9 myndu ekki mynda stöðugt flókið við þær aðstæður sem notaðar voru (denaturation) (Mynd 4A).Í viðurvist UTP og GTP sýndi massamæling hvarfsins sem innihélt nsp9 og nsp12 að próteinmassi UTP hreyfðist 306 Da og próteinmassi GTP 345 Da, sem gefur til kynna að hver nsp9 sameind binst UMP eða GMP (Mynd 4) C og D).Talið er að orkan sem þarf fyrir NiRAN-miðlaða nsp9 NMPýleringu komi frá NTP vatnsrofi og losun pýrófosfats.Þrátt fyrir að 10-falt mólar umfram nsp9 (markmið) en nsp12 (ensím) hafi verið notað í þessu hvarfi, sást næstum algjör NMPýlering á nsp9, sem gefur til kynna að víxlverkunin milli nsp12 og nsp9 sé skammvinn og nsp12 getur NMPýlerað meira nsp9 in vitro sameind.

Stök NMPýlering á nsp9 í viðurvist nsp12 og UTP eða GTP.Sýnt er afsnúið heildarpróteinmassaróf HCoV-229E nsp9 (SI viðauki, Tafla S1) (AD).(A) nsp9 eitt sér, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 í viðurvist UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 í viðurvist GTP.

Til að ákvarða nsp9 leifar UMPýleraðar með nsp12 var nsp9-UMP klofið með trypsíni.Peptíðin sem mynduðust voru aðskilin með nanó-háafkasta vökvaskiljun (HPLC) og greind með tandem massagreiningu (MS/MS) á netinu.Gagnagreining með Byonic hugbúnaðarpakkanum (Protein Metrics) sýndi UMPýleringu á N-enda amínósýrunni.Þetta er staðfest handvirkt.Tíðamassaróf undanfarapeptíðsins [UMP]NNEIMPGK (SI viðauki, mynd S5A) leiddi í ljós brot við 421 m/z, sem gefur til kynna að UMP binst leif 1 af nsp9.

Á N-enda nsp9 er Asn varðveitt meðal meðlima Orthocoronavirinae (SI viðauki, mynd S6).Þrátt fyrir að við teljum að N-enda aðal amínköfnunarefnið sé líklegasti viðtakandinn fyrir UMP, ákváðum við að fá frekari vísbendingar um NMP bindingu við N-enda.Af þessum sökum var ó-NMPýlerað og NMPýlerað N-enda peptíðið nsp9 hreinsað með HPLC fengið í nærveru asetóns og natríumsýanóborhýdríðs.Við þessar aðstæður er aðeins hægt að breyta fríum frumamínum með própýli (25).N-enda nsp9-afleidda peptíðið með röðinni NNEIMPGK inniheldur tvö aðal amín, annað í N-enda Asn og hitt í hliðarkeðju Lys í C-endanum.Þess vegna er hægt að setja própýlhópa í báða enda.Útdregin jónaskiljun af peptíða sem ekki eru NMPýleruð eru sýnd í SI viðauka, mynd S5B.Eins og búist var við er hægt að bera kennsl á N-enda og C-enda (ein)própýleruð (SI viðauka, mynd S5B, efri braut) og tvíprópuð peptíð (SI viðauki, mynd S5B, neðri braut).Þetta mynstur breytist með notkun á NMPýleruðu N-enda peptíðinu af nsp9.Í þessu tilviki er aðeins hægt að bera kennsl á C-enda própýleruð peptíð, en N-enda própýleruð peptíð og tvíprópuð peptíð eru ekki auðkennd (SI viðauki, mynd S5C), sem gefur til kynna að UMP hafi verið flutt yfir í N-enda frumamínið Til að koma í veg fyrir þetta hóp frá því að gera breytingar.

Næst skiptum við út (með Ala eða Ser) eða eyðum varðveittum leifum við N-enda nsp9 til að skilgreina marksértækar takmarkanir.Byggt á MS gögnum okkar sem sýna að NiRAN myndar nsp9-NMP adduct með aðal amíni í N-enda leifar nsp9, gerðum við tilgátu um að nsp9 NMPýlering krefst þess að veiru master próteasa (Mpro, nsp5) losi nsp9 N-enda frá forvera fjölpróteins þess.Til að prófa þessa tilgátu framleiddum við forveraprótein nsp7-11 sem innihélt nsp9 í E. coli og gerðum staðlað NMPýleringarpróf í viðurvist [α-32P] UTP (efni og aðferðir).Eins og sýnt er á mynd 5A (braut 3), er óskorinn forveri nsp7-11 ekki geislamerktur með nsp12.Aftur á móti, ef nsp7-11 er klofið með raðbrigða nsp5 til að losa nsp9 (og önnur nsps) úr forveranum, greinist geislamerkt prótein sem flytur með nsp9, sem staðfestir niðurstöðu okkar um að NiRAN og N-sértæk myndun samgildra nsp9-NMP adducts .Endanlegt aðal amín í N-enda Asn (staða 3825 í pp1a/pp1ab).Þessi ályktun er einnig studd af tilraunum sem nota nsp9 smíðina, sem inniheldur eina eða tvær leifar til viðbótar á N-endanum.Í báðum tilfellum var NiRAN-miðluð UMPýlering á nsp9 afnumin (SI viðauki, mynd S7).Næst framleiddum við prótein með einni eða tveimur Asn leifum sem var eytt úr 3825-NNEIMPK-3832 peptíð röðinni við N-enda nsp9.Í báðum tilfellum var nsp9 UMPýlering algjörlega læst (Mynd 5B), sem gefur frekari vísbendingar um að raunverulegur nsp9 N-endi virki sem NMP viðtaki.

Próteingreiningarvinnsla nsp9 og hlutverk N-enda leifa í nsp12-miðlaðri UMPýleringu.(A) nsp9 UMPýlering krefst ókeypis nsp9 N-enda.Nsp7-11-His6 er forræktað við 30 °C í NMPýleringarskynjunarbuffi sem inniheldur UTP í nærveru eða fjarveru raðbrigða Mpro (nsp5-His6).Eftir 3 klukkustundir, byrjaðu NMPýlerunargreininguna með því að bæta við nsp12-His6 eins og lýst er í Efni og aðferðir.Hvarfið sem innihélt nsp5-His6 (braut 1) og nsp9-His6 (braut 2) var notuð sem viðmið.Eftir 10 mínútur var hvarfinu hætt og hvarfblandan var aðskilin með SDS-PAGE.Próteinið var litað með Coomassie Brilliant Blue (A, efst).Nsp7-11-His6 forvera og unnin vara sem myndast við nsp5-His6 miðlaða klofning eru sýnd til hægri.Vinsamlegast athugaðu (vegna smæðar þeirra) að nsp7 og nsp11-His6 eru ekki greinanleg í þessu hlaupi, og hvarfið er bætt við nsp5-His6 (brautir 1 og 4; staðsetning nsp5-His6 er auðkennd með heilum hring) eða nsp9-His6 (braut 2) inniheldur lítið magn af MBP (táknað með opnum hringjum) sem óhreinindi sem eftir eru vegna þess að þau eru tjáð sem MBP samrunaprótein (SI viðauki, Tafla S1).(B) Nsp9-His6 afbrigðið skortir eina eða tvær N-enda Asn leifar (leifanúmerun í samræmi við staðsetningu í pp1a/pp1ab) og er hreinsað og ræktað með nsp12-His6 og [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE lituð með Coomassie er sýnd efst, B, samsvarandi sjálfsmyndataka er sýnd neðst.Staða mólþyngdarmerkisins (í kílódaltonum) er sýnd til vinstri.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-enda varðveittum leifum var skipt út fyrir Ala eða Ser, og sama magn af próteini var notað í nsp12-His6 miðluðu UMPýlerunarhvarfinu.Hvarfefnin voru aðskilin með SDS-PAGE og lituð með Coomassie Brilliant Blue (C, efst) og geislamerkt nsp9-His6 greindist með fosfórljómun (C, miðja).Með því að nota villigerð (wt) prótein sem viðmiðun (stillt á 100%) var hlutfallsleg NMPýlerunarvirkni (meðaltal ± SEM) reiknuð út frá þremur sjálfstæðum tilraunum.(D) Veirutítrar í p1 frumuræktarfrumvökvanum af Huh-7 frumum sýktar af HCoV-229E villigerð Huh-7 frumum og stökkbrigði sem bera tilgreindar amínósýruskiptingar í nsp9 voru ákvarðaðar með skelluprófi.RdRp mótíf C tvöfaldur stökkbreyttur DD4823/4AA, sem skorti eftirmyndun, var notaður sem neikvæð viðmiðun.

N-enda nsp9 (sérstaklega stöður 1, 2, 3 og 6) er mjög varðveitt meðal meðlima Orthocoronavirinae undirættarinnar (SI viðauki, mynd S6).Til þess að rannsaka hugsanlegt hlutverk þessara leifa í nsp12-miðlaðri nsp9 NMPýleringu, var tveimur samfelldum Asn leifum á N-enda nsp9 skipt út fyrir Ala eða Ser (ein og sér eða í samsetningu).Í samanburði við villigerð nsp9 leiddi það af stað N3825 fyrir Ala eða Ser til meira en tvöfaldrar minnkunar á nsp12-miðluðum UMPýleringu (Mynd 5C).Í samræmi við niðurstöðu okkar um að NMPýlering eigi sér stað við N-enda aðal amínið í stað hliðarkeðju N-enda leifarinnar, sáum við marktæka leifar af NMPýleringu með því að skipta um N3825A og N3825S.Athyglisvert er að ef annað Asn er skipt út fyrir Ala eða Ser, minnkar nsp9 UMPýlering kröftugar (meira en 10 sinnum), en skipti á Ala í stöðu 3, 4 og 6 hefur aðeins miðlungs áhrif á nsp9 UMPýleringu (Mynd 2) ).5C).Svipaðar niðurstöður fengust með því að nota ATP, CTP eða GTP (SI viðauki, mynd S8).Samanlagt gefa þessi gögn til kynna lykilhlutverk N2826 (staða 2 í nsp9) í nsp9 NMPýleringu.

Til þess að fá frekari vísbendingar um starfræna fylgni milli N-enda nsp9 og NMPýlerunar, gerðum við margfeldisröðun (MSA) á nsp9 röð Coronavirus fjölskyldunnar (breytilegt á milli 104 og 113 leifa) (SI viðauki, mynd S6).Alls, í 47 (þekktum og hugsanlegum) tegundum af 5 ættkvíslum Orthocoronavirinae undirættarinnar sem sýkja mismunandi spendýr, fugla og skriðdýrahýsil, reyndust aðeins 8 leifar alls óbreytanlegar.Víðtækustu breytingarnar, þ.mt brottfellingar og innsetningar, sáust í lotunum milli aukabyggingarþátta nsp9, eins og ákvarðað var af fyrri byggingarrannsóknum (26 ??28).Fimm óbreytanlegar leifar fundust í β streng og α helix C-enda hluta nsp9.Þrjár óbreytanlegar leifar mynda NNE mótíf á N endastöð nsp9.Það kemur í ljós að annað Asn þessa mótífs er eina óbreytilega leifin, sem einnig er deilt með tilgátu nsp9 af fjarskylda froskakórónaveirunni, og táknar Microhyla letovirus 1 tegundina í undirættinni Letovirinae af Alphaletovirus.Hægt er að hagræða varðveislu leifa í nsp9 aukabyggingarþáttum með byggingarsjónarmiðum til að viðhalda brjóta saman eða þekktum RNA bindandi eiginleikum.Hins vegar virðist þessi röksemdafærsla ekki eiga við um varðveislu NNE og fyrir þessa rannsókn var eðli þeirra takmarkana sem takmarka breytileika þrípeptíðröðarinnar algjörlega hulið.

Til að ákvarða mikilvægi nsp9-NMPýleringar og NNE varðveislu í afritun kransæðaveiru, framleiddum við HCoV-229E stökkbrigði, sem bera stakar eða tvöfaldar skiptingar á nsp9 N-enda leifum, sem gefur til kynna að nsp9 NMPýlering sé skaðleg in vitro.Áður en við byrjum reynum við að svara spurningunni hvort þessar skiptingar (nálægt nsp8|9 klofningsstaðnum) hafi áhrif á próteinlýsuvinnslu C-enda pp1a svæðisins.Setja af nsp7-11 fjölpróteini smíðum sem innihéldu samsvarandi útskiptingar á N-enda nsp9 voru framleidd í E. coli og skorin með raðbrigða Mpro.Próteinleysandi klofning staðanna fjögurra (þar á meðal nsp9 hliðarstaðarins) hefur ekki marktæk áhrif á neinar innleiddar útskiptingar (SI viðauki, mynd S9), að undanskildum byggingarbreytingum á þessum próteinum sem trufla Mpro-miðlaða nsp8|9 klofningu (Eða annað) vefsíðu.

Huh-7 frumur voru umbreyttar með erfðamengislengd HCoV-229E RNA, sem kóða Ala eða Ser skipti í varðveittu NNE þrípeptíðunum (N3825, N3826 og E3827) á nsp9 N endastöðinni, sem sýnir að flestar stökkbreytingarnar eru banvænar.Okkur tókst að bjarga vírusnum með því að skipta út Ser eða Ala af N-enda Asn (N2835A eða N2835S), en tókst ekki að endurheimta veiruna með öðrum stakum og tvöföldum stökkbreytingum í NNE röðinni (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Mynd 5D).

Þessar niðurstöður benda til þess að afritun kórónaveirunnar í vefjarækt sé takmörkuð (sama eða svipuð), sem takmarkar náttúrulega stökkbreytingu á nsp9 NMPýleringarstöðum í líkamanum og styður lykilhlutverk þessarar svörunar í lífsferli kórónaveirunnar.

Í síðasta setti tilrauna framleiddum við C-enda His6 merkt SARS-CoV-2 nsp12 og nsp9, og tvö stökkbreytt form af nsp12 í E. coli.Virku svæðisleifarnar í NiRAN og RdRp lénunum voru hvort um sig Notaðu Ala í staðinn (Mynd 6A og SI viðauki, Tafla S2).K4465 í SARS-CoV-2 nsp12 samsvarar K4135 í HCoV-229E (SI viðauki, mynd S2), sem reyndist vera nauðsynlegt fyrir NiRAN virkni og HCoV-229E afritunar (mynd 3D og E).Þessi leifar samsvarar einnig slagæðaveiru EAV nsp9 K94 leifum, sem áður var sýnt fram á að væri nauðsynlegt fyrir NiRAN sjálf-UMPýlering/sjálf-GMPýlering (16).Eins og sýnt er á mynd 6B, hefur SARS-CoV-2 nsp12 UMP transferasa virkni með því að nota nsp9 sem hvarfefni, en nsp12_K4465A stökkbreytturinn á virka stað er óvirkur.Tvöföld skiptingin í SDD einkennandi röð RdRp mótífs C hefur ekki áhrif á UMP transferasa virkni (Mynd 6B), sem gefur til kynna að RdRp virkni hafi engin bein áhrif í nsp9 UMPýleringu.Svipuð gögn voru fengin með því að nota CTP, GTP og ATP (SI viðauki, mynd S10).Í stuttu máli benda þessi gögn til þess að NiRAN-miðluð nsp9 NMPýlering hafi íhaldssama virkni í kransæðaveirum sem tákna mismunandi ættkvíslir orthocoronavirus undirfjölskyldunnar.

SARS-CoV-2 nsp12-miðluð NMPýlering á nsp9.(A) Coomassie litað SDS-pólýakrýlamíð hlaup sem sýnir raðbrigða próteinið sem notað var í NMPýlerunarprófinu.Sem viðmiðun var stökkbreytt prótein með virkum staðskiptum í NiRAN léninu (K4465A) og RdRp léninu (DD5152/3AA) af SARS-CoV-2 nsp12 notað.Númer leifa byggir á staðsetningu í pp1ab.(B) Sjálfsröntgenmynd af UMPýlerunargreiningu með því að nota nsp9-His6 og [α-32P]UTP sem hvarfefni nsp12-His6 (villigerð [wt] og stökkbreytt).Sameindamassi (í kílódaltonum) merkta próteinsins er sýndur til vinstri.

NiRAN lén eru almennt varðveitt í Nidovirales (16), sem gefur til kynna að þau hvetji ensímhvörf sem eru nauðsynleg fyrir afritun nídóveiru.Í þessari rannsókn tókst okkur að sanna að NiRAN lén kransæðavírussins flytur NMP (myndað úr NTP) til nsp9, dularfullt RNA bindiprótein sem tekur þátt í afritun vírusa (26 ?? 29 ), til að ákvarða það sem náttúrulegt skotmark og samstarfsaðili coronavirus RTC.

NiRAN lénið deilir þremur raðmyndum (AN, BN og CN), sem innihalda mjög lítinn fjölda leifa sem varðveitast í öllum fjölskyldum í einkynja en mjög aðgreindri Nidovirales röð (8, 16).Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að þau eru byggingarlega skyld að mestu leyti óeinkenndri fjölskyldu próteinkínasalíkra próteina, sem upphaflega voru kölluð SelO fjölskyldan (17, 19, 22, 30, 31).SelO-tengd prótein hafa kínasafellingar, en skortir nokkrar varðveittar virka staði leifar í klassískum kínasa (22, 32).Byggt á öfugri stefnu ATP sameinda bundnar við virka staðinn og stöðugar með sérstökum milliverkunum, var sett fram tilgáta SelO og í kjölfarið staðfest að það flytti AMP (í stað fosfats) til próteinhvarfefnisins (22), en annað SelO-líkt prótein YdiU hefur nýlega hefur verið sýnt fram á að hvetja samgilda tengingu UMP við Tyr og His leifar mismunandi próteinhvarfefna (33).

Til þess að staðfesta og stækka spána um væntanlegar leifar af virkum staði kórónaveirunnar NiRAN lénsins notuðum við lífefnafræðilegar og öfuga erfðafræðiaðferðir til að framkvæma stökkbreytingargreiningu á kransæðaveirunni nsp12 (Mynd 3D og E og SI viðauki, mynd S3 og tafla) S1â S4).Gögnin sýna að það að skipta út HCoV-229E K4135, R4178 og D4280 með Ala útilokar in vitro NMP transferasavirkni og vírusafritun í frumurækt (Mynd 3D og E og SI viðaukar, mynd S3), sem styður viðveru þeirra í NTP γ-fosfati. ( K4135, R4178) og samhæfingu málmjóna á virkum stað (D4280).Sýnt hefur verið fram á að E4145A skiptingin á varðveittu Glu á sviði fuglahreiðurveiru sem spáð er stöðugleika á K4135 (17) stöðunni útiloki veiruafritun, en furðu, virknin hélst í in vitro NMPýlerunarprófinu (mynd 3D og E og SI viðauki, mynd S3 og töflur S1–S4).Svipuð athugun var gerð þegar samsvarandi staðgengill var tekinn upp í YdiU homolog Salmonella typhimurium (E130A) (33).Samanlagt styðja þessi gögn stjórnunarvirkni þessarar varðveittu leifa frekar en hvatavirkni.

Að skipta út varðveittu Phe leifunum (F4281A) innan sviðs nestoveiru í HCoV-229E NiRAN léninu (8) leiddi til minnkunar á NMPýleringarvirkni in vitro og marktækrar minnkunar á afritun vírusa í frumurækt (mynd 3D, E og SI) viðauka, mynd S3).Gögnin eru í samræmi við mikilvæga stjórnunarvirkni þessarar leifar, svo sem einsleita DFG mótíf Phe leifar sem sýnd var áður.Í klassískum próteinkínasa er það hluti af Mg2+ bindilykkjunni og hjálpar til við að setja saman og stjórna hryggnum???Nauðsynlegt fyrir árangursríka hvatavirkni (32, 34).Með því að skipta út Ala og Arg fyrir K4116 leifar (í preAN mótífinu), í sömu röð, útrýmdi veiruafritun og, eins og búist var við, hafði mismunandi áhrif á NMP transferasa virkni in vitro, allt eftir amínósýru hliðarkeðjunni sem kynnt var (mynd 3D og E og SI viðaukar , mynd S3).Virknigögnin eru í samræmi við byggingarupplýsingarnar, sem gefa til kynna að þessi leifar hafi komið á víxlverkun við ATP fosfat (17).Í NiRAN léni annarra hreiðraðra vírusafjölskyldna er staða HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 upptekin af Lys, Arg eða His (8), sem gefur til kynna að slakað hafi verið á virknitakmörkunum á þessari sértæku leifar.Skipting á D4188A og D4283A útilokar eða dregur verulega úr ensímvirkni og útilokar afritun vírusa (Mynd 3).Þessar tvær leifar eru varðveittar í flestum (en ekki öllum) hreiðri veirum (8), sem gefur til kynna mikilvæga fjölskyldusértæka en hugsanlega ekki hvatavirkni.Ala skipti á nokkrum öðrum Lys og Asp leifum (K4113A, D4180A, D4197A og D4273A) sem eru ekki varðveitt í Coronaviridae eða öðrum Nestioviridae fjölskyldum (8) voru notaðar sem viðmið.Eins og búist var við eru þessar útskiptingar að mestu þolanlegar, með lítilsháttar minnkun á ensímvirkni og veiruafritun í sumum tilfellum (mynd 3 og SI viðauki, mynd S3).Á heildina litið eru gögn um stökkbreytingu kransæðaveirunnar mjög í samræmi við sjálf-GMP og gagnstæða erfðafræðigögn EAV NiRAN-RdRp (16), þar sem EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) leifar K94 (sem samsvarar HCoV-229E K4135) gegnir mikilvægu hlutverki), R124 (samsvarar R4178), D132 (samsvarar D4188), D165 (samsvarar D4280), F166 (samsvarar F4281).Að auki eru gögn um stökkbreytingu HCoV-229E í samræmi við og stækkuð frá áður tilkynntum SARS-CoV gagnvirkum erfðafræðilegum gögnum (16), alveg eins mjög svipuð þeim sem sést hafa fyrir samsvarandi CN mótíf Phe-to-Ala stökkbreytt SARS-CoV_nsp12. svipgerð lýst -F219A og HCoV-229E_F4281A (Mynd 3 D og E og SI viðauki, mynd S3 og tafla S1-S4).

Í samanburði við EAV orthologs (16), sem hafa greinilega val fyrir UTP og GTP (í sjálfs-NMPýlerunarviðbrögðum), sýnir rannsókn okkar að kórónavírus NiRAN lénið (táknað með HCoV-229E og SARS-CoV-2) getur verið á áhrifaríkan hátt flutt Öll fjögur NMP, þó að það sé örlítið val fyrir UMP (myndir 1 og 3).Tiltölulega lítil sérhæfni sértæka NTP samhvarfefnisins er í samræmi við nýlega tilkynnt SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ofursamsett uppbyggingu, þar sem ADP-Mg2+ binst virka stað NiRAN, en ekki við adenín hluta af myndun sérstakra milliverkana (17).Í rannsókn okkar hefur tegund núkleótíðs sem notuð er í NMPýlerunarviðbrögðum engin mismunandi áhrif á virkni stökkbreytta próteinsins (SI viðauki, mynd S3), sem gefur til kynna að engin þessara leifa sé náskyld bindingu tiltekins núkleóbasa.Enn á eftir að rannsaka byggingargrundvöll og hugsanlega líffræðilega þýðingu mismunandi NTP samhvarfefnavals sem sést á NiRAN lénum kransæðaveira og slagæðaveira;þær geta verið sannar eða geta stafað af takmörkunum viðkomandi náms.Sem stendur er ekki hægt að útiloka að hugsanleg NMPylator virkni NiRAN lénsins í slagæðaveiru (samanborið við áður einkennandi sjálf-NMPýleringarvirkni) hafi mismunandi val á samhvarfefni, að teknu tilliti til þess að líkt er á milli slagæðarinnar og kransæðaveirunnar. NiRAN lénið er á takmörkunum.Sequence-based Compare (16).Samanborið við gervi-SelO, sem notar Mg2+ sem cofactor, er virkni kransæðavírus og slagæðaveiru NiRAN háð Mn2+ (16) (Mynd 3C og SI viðauki, mynd S1).Mn2+ ósjálfstæði og augljóst val fyrir UTP er óvenjulegur eiginleiki próteina NMPýlatora, og hefur aðeins nýlega verið staðfest í YdiU próteini Salmonella typhimurium, sem hvetur stranga Mn2+ háða próteinforingja UMPýleringu til að vernda frumur gegn streituframkalla ATP safn fruma ( 33).

Byggingarlíkindin sem nýlega lýst er á milli NiRAN lénsins kransæðaveirunnar og frumu próteinkínasa (17, 19) veitir frekari stuðning við getu NiRAN til að tengja NMP með samgildum hætti við önnur prótein sem við höfum greint frá í þessari rannsókn.Við einbeitum leit okkar að mögulegum NiRAN-markmiðum á próteinin sem Kóðuð eru af HCoV-229E ORF1a, sem vitað er að beint eða óbeint aðstoða RTC ORF1b-kóðaða eftirmynd (12, 35).Tilraunir okkar veita óyggjandi sannanir fyrir skilvirkri og sértækri NMPýleringu nsp9 (mynd 2).Ef markpróteinið er notað í mólumframmagn sem er 8 til 10 sinnum hærra en ensímið (nsp12), er staðfest að nsp9 er algjörlega (ein)NMPized (mynd 4).Við komumst að þeirri niðurstöðu að víxlverkunin milli nsp12 og nsp9 er skammvinn og myndar ekki stöðugt flókið með nsp9 (þar sem aðrar RTC undireiningar eru ekki til).Þessi niðurstaða er studd af rannsóknum á milliverkunum próteina á SARS-CoV próteininu (35).MS greining benti á aðal amínið í N-enda leifinni af nsp9 sem NMPýleringarstaðinn (SI viðauki, mynd S5).Myndun fosfóramídattengisins og N-enda amínóhópsins aðgreinir NiRAN-miðlaða NMPýlerunarvirkni frá Pseudomonas syringae SelO-miðluðu AMPýlerunarhvarfi, sem hvetur myndun O-tengds AMP við Ser, Thr eða Tyr leifar Peptíðadduct ( 22), og S. typhimurium YdiU myndar O-tengdar (með Tyr) og N-tengdar (með His) peptíð-UMP adducts.Takmarkaðar upplýsingar sem til eru um SelO próteinfjölskylduna benda til þess að meðlimir þessarar stóru próteinafjölskyldu séu mjög mismunandi hvað varðar myndun peptíð-NMP adducts.Þetta er athyglisverð athugun sem verðskuldar frekari rannsókn.

Gögnin sem fengust í þessari rannsókn leiddu til þess að við gerðum þá tilgátu að NMPýlering nsp9 krefst frjálss N-enda.Í samhengi við veiruafritun, verður þetta veitt með próteingreiningu klofnunar á nsp8|nsp9 vinnslustaðnum í fjölpróteininu pp1a sem miðlað er af Mpro og pp1ab.Í flestum kransæðaveirum er munurinn á þessum tiltekna stað (VKLQ|NNEI í HCoV-229E) og öllum öðrum Mpro klofningsstöðum kransæðaveiru Asn (frekar en önnur lítil leifar, eins og Ala, Ser eða Gly) taka P1â???Staðsetning (36).Gögnin um peptíðklofnun sem fengust í fyrstu rannsóknunum sýndu að klofningsvirkni nsp8|nsp9 staðarins var minni en annarra staða, sem gefur til kynna að 1) þessi tiltekni staður gæti haft stjórnunarhlutverk í tímanlegri samræmdri vinnslu C-enda. pp1a svæði, eða 2) a Hlutverk hins sérstaka varðveitta nsp9 N-enda í vírusafritun (37).Gögnin okkar (Mynd 5A) sýndu að raðbrigðaform nsp9 sem ber raunverulegu N-enda röðina var í raun NMPized af nsp12.N-enda hliðarröðin var fjarlægð með þætti Xa (nsp9-His6; SI viðauki, Tafla S1) eða Mpro-miðlaðri klofningu (nsp7-11-His6; Mynd 5A og SI viðauki, Tafla S1).Mikilvægt er að óskorinn nsp9-innihaldandi undanfari nsp7-11-His6 sýndi viðnám gegn NMPýleringu á nsp12, sem er í samræmi við gögn okkar, sem gefur til kynna að nsp9-NMP addukið sé myndað í gegnum N-enda aðal amínið (SI viðauki, mynd S5) .Til að öðlast dýpri skilning á sérhæfni NiRAN hvarfefnis, einbeittum við okkur síðan að aðliggjandi N-enda leifum nsp9.Í fjarveru annarra próteina eru þau sveigjanleg í byggingu, sem kemur í veg fyrir að þau greindist á ómerktu formi nsp9 (26 28, 38), sem gefur til kynna takmarkaðan náttúrulegan breytileika þeirra. virkni nsp9 N-enda brotsins.Ala skiptingar á varðveittum leifum á þessu svæði (myndir 5C og D og SI viðauki, mynd S8) sýna að N3826 er nauðsynlegt fyrir nsp9 NMPýleringu in vitro, en N3825A og E3827A skiptingar leiða til minnkunar á NMPýleringu, en M3829A og P3830A skiptingar gera það ekki .Augljóslega hafa áhrif á nsp9 NMPýleringu.Þó að skipting á N-enda Asn (N3825A, N3825S) hafi aðeins miðlungs áhrif á nsp9 NMPýleringu og vírusafritun í frumurækt (Mynd 5C og D), eyðir Asn leifarröð úr N-enda 3825-NN tvípeptíðinu. reyndist vera það er banvænt fyrir veirur, sem gefur til kynna að einn Asn leifar þurfi á undan annarri leifar á N-endanum, helst Asn, þó svo að það virðist sem hægt sé að þola skiptingu svipaðra leifa að hluta (Mynd 5B, C og D).Við ályktum að 3825-NN tvípeptíðið, sérstaklega varðveitta og nauðsynlega N3826 leifin innan kransæðavírussviðsins (SI viðauki, mynd S6), tryggir rétta bindingu og stefnu nsp9 N-enda á virka stað NiRAN.

Ef Ala (E3827A) er skipt út fyrir varðveitt Glu af öllum undirfjölskyldum, heldur nsp9 NMPýleringu in vitro en er banvænt vírusum í frumurækt (Mynd 5C og D), sem gefur til kynna viðbótarvirkni þessarar leifar, til dæmis í lykilvíxlverkunum (NMPýleruð eða óbreytt) ) nsp9 N-enda og aðrir þættir sem taka þátt í afritun vírusa.Nsp9 stökkbreytingar höfðu ekki áhrif á próteingreiningarferli nsp9 eða neinna aðliggjandi nsps (39) (SI viðauki, mynd S9), sem gefur til kynna að banvænar svipgerðir nokkurra nsp9 stökkbreytinga sem komu fram hafi ekki verið af völdum vanstjórnunar á C próteingreiningarferlisenda pp1a svæðinu. .

Ofangreind gögn gefa vísbendingar um að eftir Mpro-miðlaða meðferð á nsp8|9 klofningsstaðnum í pp1a/pp1ab, er hægt að UMPýlera N-enda nsp9 (eða breyta að hluta með öðru NMP).Að auki leiddi frábær varðveisla N-enda nsp9 (þar á meðal eintölu og óbreytilegu Asn leifar í kransæðaveirufjölskyldunni) og gagnstæða erfðafræðigögn sem fengust í þessari rannsókn (myndir 3E og 5D) okkur til að álykta að lýst nsp9 NMPýlering er líffræðilega skylt og nauðsynlegt fyrir afritun kransæðaveiru.Það á eftir að rannsaka hagnýtar afleiðingar þessarar breytingar, til dæmis varðandi áður lýst (ósérhæfð) nsp9 (óbreytt form) RNA bindandi virkni (2628).N-enda NMPýlering getur einnig haft áhrif á samspil nsp9 við prótein eða RNA hvarfefni eða myndun mismunandi fjögurra stiga samsetninga.Þessar hafa komið fram í byggingarrannsóknum og hefur verið staðfest að þær tengdust virkni kórónavírusafritunar, þó sérstaklega ef ekki er um að ræða. Ef um þessa breytingu er að ræða (26- ââ29, 40).

Þrátt fyrir að enn þurfi að skilgreina marksérhæfni kórónavírus NiRAN lénsins nánar, sýna gögn okkar að próteinmarksérhæfni kórónavírus NiRAN lénsins er mjög þröng.Þrátt fyrir að varðveisla lykilleifa virka staða (8, 16) í NiRAN léni allra nídóveirufjölskyldna styðji eindregið virkni varðveitta NMPylator þessara próteina, þá á enn eftir að einkenna auðkenni hvarfefnisbindandi vasaleifa þessa léns. Varðveisla og verndun , og getur verið mismunandi eftir mismunandi fjölskyldum af Nidovirales tilgangi.Að sama skapi hefur enn ekki verið ákveðið hvaða skotmörk annarra hreiðraðra vírusa eiga við.Þeir geta verið fjarlægir réttvísar nsp9 eða annarra próteina, vegna þess að raðir utan fimm eftirlíkingalénanna sem eru almennt varðveittar í hreiðruðum vírusum eru minna varðveittar (8), þar á meðal erfðamengisfjöllin milli Mpro og NiRAN, þar á meðal er nsp9 staðsett í kórónuveiran.

Að auki getum við ekki útilokað að NiRAN lénið hafi fleiri (þar á meðal frumu) skotmörk.Í þessu tilfelli er rétt að minnast á að bakteríusamstæður í þessu nýja próteini NMPylators (NMPylators) (30, 31) virðast hafa "meistara eftirlitsaðila"?NMP mótar margs konar frumuprótein til að stjórna eða útrýma niðurstreymisvirkni þeirra, og gegna þar með hlutverki í ýmsum líffræðilegum ferlum, svo sem frumustreituviðbrögðum og redox homeostasis (22, 33).

Í þessari rannsókn (myndir 2 og 4 og SI viðauki, myndir S3 og S5), tókst okkur að sanna að nsp12 flutti UMP (NMP) hlutann í eina (varðveitta) stöðu í nsp9, á meðan önnur prótein voru ekki breytt í notað Við þær aðstæður er vel skilgreind (frekar en laus) undirlagssérhæfni studd.Í samræmi við þetta, samanborið við N-enda nsp9 NMPýleringu, er eigin NMPýleringarvirkni nsp12 mjög lítil, uppgötvun þess krefst lengri útsetningartíma sjálfsmyndatöku og 10-föld aukning á styrk nsp12 er notuð.Að auki tókst MS-greining okkar ekki að veita vísbendingar um NMPýleringu á nsp12, sem bendir til þess að sjálf-NMPýlering NiRAN léns sé (í besta falli) aukavirkni.Hins vegar skal tekið fram að aðrar rannsóknir hafa gefið bráðabirgðavísbendingar um að sjálfs-AMPýleringarstaða bakteríu NMPylator geti stjórnað NMPýleringarvirkni þeirra á öðrum próteinhvarfefnum (22, 33).Þess vegna er þörf á frekari rannsóknum til að kanna möguleg virkniáhrif sjálfs-NMPýleringarvirkni sem tilkynnt er um fyrir EAV nsp9 (16) og kransæðaveiru nsp12 (þessi rannsókn), þar á meðal fyrirhuguð leiðtogalík áhrif á samanbrot C-enda RdRp lénsins ( 16)).

Áður hafa nokkrar tilgátur um mögulega niðurstraumsvirkni nidoveiru NiRAN lénsins verið skoðaðar, þar á meðal RNA lígasa, RNA-toppað gúanýlattransferasa og prótein frumunarvirkni (16), en engin þeirra er í samræmi við tiltæka niðurstraumsvirkni.Upplýsingarnar sem aflað er í eftirfarandi stöðum eru nákvæmlega á sama tíma án þess að gera frekari forsendur.Gögnin sem fengust í þessari rannsókn eru mest í samræmi við (en geta ekki sannað) að NiRAN lénið eigi þátt í að hefja prótein-framkallaða RNA nýmyndun.Áður var talið að virkni NiRAN lénsins í 5??²-RNA lokun eða RNA bindingarviðbrögð verða ekki fyrir áhrifum af þessum og stuðningi við önnur gögn.Þess vegna er til dæmis talið að virki staður NiRAN feli í sér varðveitta Asp sem almennan grunn (D252 í Pseudomonas syringae SelO; D4271 í HCoV-229E pp1ab; D208 í SARS-CoV-2 nsp12) (SI viðauki, mynd 2) ).S2) (17, 22, 33), en hvatning í ATP-háða RNA lígasa og RNA lokunarensíminu fer fram af samgilda ensíminu-(lysýl-N)-NMP milliefni, sem felur í sér óbreytta Lys leifa ( 41).Að auki er ótrúleg raðbundin sérhæfni kórónaveirunnar NiRAN fyrir varðveitt próteinmarkmið og slakað sérhæfni fyrir NTP samhvarfefni (kýs UTP) á móti NiRAN-miðluðu lokunarensími eða RNA lígasa-líkum aðgerðum.

Augljóslega þarf mikla aukavinnu til að sannreyna og, ef sannað er, útskýra hugsanlegt hlutverk nsp9-UMP (nsp9-NMP) í próteinframkölluðum RNA nýmyndun, sem mun tengja saman nokkrar áhugaverðar en (enn sem komið er) skýrslur sem áður hefur verið greint frá. .Einangraðar athuganir.Til dæmis hefur verið ákvarðað að endir neikvæða strengs RNA kransæðaveirunnar byrji á oligo(U) þræði (42, 43).Þessi athugun er í samræmi við hugmyndina um að myndun neikvæða strengs RNA sé hafin með því að binda UMPýlerað form nsp9 við poly(A) hala (kveikjur), sem getur verið ýtt undir með RNA-bindingu þess Virkni og/eða víxlverkun við annað RTC prótein.UMP hlutann sem nsp9 veitir er síðan hægt að nota sem „primer“ fyrir nsp7/8/nsp12-miðlaða fákeppni, með því að nota 3??²-poly(A) hala í erfðafræðilegu RNA eða annarri oligo (A)-röð sem inniheldur þjónar sem sniðmát, svipað og fyrirkomulagið sem komið var á fyrir picornavirus VPg próteinið (44).Hvað ef tillagan er „ekki staðlað“????Upphaf (prótein-framkallaðrar) myndun neikvæðra strengs RNA gefur tengingu við athuganirnar, sem gefur til kynna að neikvæða strengja RNA kransæðaveirunnar hafi UMP (í stað UTP) í lok þess (42), sem er talið benda til þess að kjarnsýra Dicer klýfur endann sem er fosfórýlaður af óþekktum uridínsértækum endónukleasa.Ef hún er staðfest getur þessi vatnsrofsvirkni kjarnsýra hjálpað til við að losa fáliðað UMPýlerað form nsp9 frá 5 ² enda neikvæða strengsins sem er í uppsiglingu.Mögulegt hlutverk nsp9 í frumun próteina er einnig í samræmi við fyrri rannsóknir á öfugum erfðafræði, sem hafa sýnt að nsp9 (og nsp8) hafa gagnrýnin og sértæk samskipti við varðveitta cis-verkandi RNA frumefnið nálægt 3 enda genamengi kransæðaveirunnar.45).Samkvæmt þessari skýrslu er nú hægt að endurskoða þessar fyrri athuganir og útvíkka þær með frekari rannsóknum.

Í stuttu máli, gögn okkar ákváðu tiltekna virkni sérstakrar hreiðurs vírusensímmerkis sem er tengt við RdRp á N-endanum.Í kransæðaveiru er þessi nýuppgötvuðu NiRAN-miðluðu UMPylator/NMPylator virkni notuð til að treysta á Mn2+ og aðliggjandi Asn leifar og valda myndun (lítilorku) fosfóramídattengja við N-enda aðal amínið.Í gegnum Mpro-miðlaða klofningu á nsp8|9 klofningsstaðnum er hægt að nota nsp9 markið fyrir NMPýleringu, sem gefur til kynna virka tengingu milli próteasans og NiRAN lénsins, sem nær til RdRp.Varðveisla lykilleifa á virka staðnum nsp12 NiRAN og nsp9-markmiðinu, ásamt gögnum sem fengin eru úr tveimur kransæðaveirum, þar á meðal SARS-CoV-2, gefur sterkar vísbendingar um að nsp9 NMPýlering sé kransæðavírus. Íhaldssamir eiginleikar eru einnig lykilskref í afritun vírusa.Fyrirliggjandi gögn leiða okkur til þess að álykta að sérstakt hlutverk NMPýleraðs forms nsp9 í próteinframkölluðum RNA nýmyndun sé hæfileg atburðarás fyrir kransæðaveiru og aðrar hreiður vírusar, og NiRAN gæti einnig miðað á önnur óþekkt prótein.Stjórna vírusnum.Samskipti við gestgjafa.Ef það er staðfest, mun þátttaka próteina frumra í veiru RNA nýmyndun auka raðsækni Mpro/3CLpro og RdRp lénanna á milli kórónaveirunnar sem áður hefur fundist og picornaveirulíkur ofurhópur (9), sem hafa nú verið sameinaðir í nýlega stofnuðu Pisonivirites ( 46) í flokknum.

Gögnin okkar sýna einnig að grunn, sértæka og íhaldssama ensímvirkni sem greint er frá í þessari rannsókn er hægt að nota sem skotmörk fyrir veirueyðandi lyf.Hægt er að þróa efnasambönd sem trufla bindingu (og síðari breytingu) á varðveittu nsp9 N-endanum á virka stað NiRAN í áhrifarík og fjölhæf veirueyðandi lyf sem henta til meðhöndlunar á kórónuveirum dýra og manna frá mismunandi (undir)ættkvíslum sýkingum. , þar á meðal SARS-CoV-2 og öndunarfæraheilkenni í Mið-Austurlöndum Coronavirus.

Kóðunarröð kórónavíruspróteinsins sem framleidd var í þessari rannsókn var mögnuð upp með RT-PCR með því að nota RNA einangrað úr Huh-7 sýkt af HCoV-229E eða Vero E6 sýkt af SARS-CoV-2 og sett inn með stöðluðum klónunaraðferðum.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) eða pASK3-Ub-CHis6 (47) tjáningarvektor (SI viðauki, töflur S1 og S2).Stökkbreytingar á stakum kódonum voru innleiddar með PCR-byggðri staðstýrðri stökkbreytingu (48).Til að framleiða MBP samrunaprótínið var E. coli TB1 frumum umbreytt með viðeigandi pMAL-c2 plasmíð smíði (SI viðauki, Tafla S1).Samrunapróteinið var hreinsað með amýlósa sækniskiljun og klofið með þætti Xa.Í kjölfarið var C-enda His6-merkt próteinið hreinsað með Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) eins og áður hefur verið lýst (49).Til að framleiða ubiquitin samrunapróteinið notuðu E. coli TB1 frumur viðeigandi pASK3-Ub-CHis6 plasmíð smíði (SI viðauki, töflur S1 og S2) og pCGI plasmíð DNA sem kóðar fyrir ubiquitin sértæka C-enda hýdrólasa 1 (Ubp1).Umbreyting (47).C-enda His6-merkt kransæðavíruspróteinið var hreinsað eins og áður hefur verið lýst (50).

Sjálf-NMPýleringarpróf HCoV-229E nsp12-His6 var framkvæmt eins og lýst er í EAV nsp9 (16).Í stuttu máli, nsp12-His6 (0,5 µM) inniheldur 50 mM 4-(2-hýdroxýetýl)-1-píperasínetansúlfónsýru (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM díþíótreítól (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM jafnalausn tilgreint NTP og 0,17 µM pössuðu við [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmól; Hartmann Analytic) við 30 °C í 30 mínútur.Í öllum öðrum (stöðluðum) NMPýleringarprófum á nsp12-miðlaðri nsp9 NMPýleringu, eru hvarfskilyrðin stillt sem hér segir: nsp12-His6 (0,05 µM) og nsp9-His6 (4 µM) í viðurvist 50 mM HEPES-KOH (pH 8). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM gaf til kynna NTP og 0,17 µM samsvarandi [a32-P]NTP.Eftir ræktun í 10 mínútur við 30°C var hvarfsýninu blandað saman við SDS-PAGE sýnislausn: 62,5 mM tris(hýdroxýmetýl)amínómetan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glýseról og 0,005% brómófenól blár.Próteinið var afeðlað með því að hita það við 90°C í 5 mínútur og aðskilið með 12% SDS-PAGE.Gelið er fest og litað með Coomassie Brilliant Blue lausn (40% metanóli, 10% ediksýra, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), aflitað og útsett fyrir fosfórlýsandi myndskjá í 20 klukkustundir (til að greina nsp12 frá NMPylering) eða (hámark) 2 klukkustundir (til að meta nsp9 NMPýleringu).Typhoon 9200 myndavél (GE Healthcare) var notuð til að skanna skjáinn og ImageJ var notað til að greina merkistyrkinn.

Fyrir MS greiningu voru 1 µM nsp12-His6 og 10 µM nsp9 (án hexahistidínmerkis) notuð í NMPýlerunargreiningu (SI viðauki, Tafla S1) og aukinn styrkur 500 µM UTP og GTP var notaður.Það fer eftir styrk þeirra og væntanlegum próteingæðum, Waters ACQUITY H-Class HPLC kerfi búið MassPrep súlu (Waters) var notað til að afsalta 1 til 10 µL af jafnaðarpróteinlausnum á netinu.Afsaltaða próteinið er skolað út í rafúðunarjónagjafa Synapt G2Si massarófsmælis (Waters) í gegnum eftirfarandi halla af jafnalausn A (vatn/0,05% maurasýru) og jafnalausn B (asetónítríl/0,045% maurasýru) og súluhitastigið er 60°C og flæðihraði 0,1 ml/mín.: skolað er jafnt með 5% A í 2 mínútur, síðan línulegur halli í 95% B innan 8 mínútna og haldið 95% B í aðrar 4 mínútur.

Jákvæðar jónir með massabilið 500 til 5000 m/z finnast.Glu-fibrinopeptide B er mælt á 45 sekúndna fresti fyrir sjálfvirka massareksleiðréttingu.Notaðu MassLynx hljóðfærahugbúnað með MaxEnt1 framlengingu til að afsnúa meðaltalsrófið eftir að grunnlína hefur verið dregin frá og jöfnun.

UMPýlerað HCoV-229E nsp9 var melt með því að bæta við raðgreiningu breyttu trypsíni (Serva) og ræktað yfir nótt við 37 °C.Chromabond C18WP snúningssúla (hlutanúmer 730522; Macherey-Nagel) var notuð til að afsalta og þétta peptíðin.Að lokum var peptíðið leyst upp í 25 µL af vatni, sem innihélt 5% asetónítríl og 0,1% maurasýru.

Sýnin voru greind með MS með því að nota Orbitrap Velos Pro massagreiningarmæli (Thermo Scientific).Fullkomið nanoâ HPLC kerfi (Dionex), búið sérsniðnum endafestum 50 cm??75 μm C18 RP súla pakkað með 2,4 μm segulmagnaðir perlur (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Tengstu massarófsmælinum á netinu í gegnum Proxeon nanóúðagjafann;sprautaðu 6 µL af trypsín meltingarlausn í 300 µm innra þvermál ×??1 cm C18 PepMap forþéttingarsúla (Thermo Scientific).Með því að nota vatn/0,05% maurasýru sem leysi, var sýnið sjálfkrafa innilokað og afsaltað við flæðihraða 6 µL/mín.

Eftirfarandi halli vatns/0,05% maurasýru (leysir A) og 80% asetónítríls/0,045% maurasýru (leysis B) voru notaðir til að ná aðskilnaði tryptic peptíða með flæðihraða 300 nL/mín.: 4% B fyrir 5 mínútur, síðan 30 A línulegur halli í 45% B innan nokkurra mínútna og línuleg aukning í 95% leysi B innan 5 mínútna.Tengdu litskiljunarsúluna við ryðfríu stáli nanóútvarpa (Proxeon) og úðaðu skolvatninu beint á upphitaðan háræða massagreiningarmælisins með því að nota 2.300 V spennu. Könnunarskönnunin með 60.000 upplausn í Orbitrap massagreiningartækinu tengist með að minnsta kosti þremur gögnum MS/MS skannanir, breytilega útilokaðir í 30 sekúndur, með því að nota línulega jónagildru árekstra af völdum sundurgreiningar eða meiri orku árekstra sundrun ásamt sporbrautarskynjun , Upplausnin er 7.500.


Pósttími: 03-03-2021